Длинный

Том 13 научных отчетов, номер статьи: 11652 (2023) Цитировать эту статью

555 доступов

8 Альтметрика

Подробности о метриках

Редактирование генома CRISPR — мощный инструмент для выяснения биологических функций. Чтобы модифицировать геном по назначению, важно понимать различные способы рекомбинации, которые могут произойти. В этом исследовании мы сообщаем о сложных векторных вставках, которые были идентифицированы во время генерации условных аллелей с помощью редактирования CRISPR с использованием соединения концов, опосредованного микрогомологией (MMEJ). Нацеливающий вектор содержал две последовательности loxP и фланкирующие микрогомологии длиной 40 п.н. Геномные области, соответствующие последовательностям loxP, были расщеплены Cas9 в эмбриональных стволовых клетках мыши. ПЦР-скрининг на направленную рекомбинацию выявил высокую частоту полос большего размера, чем ожидалось. Секвенирование этих полос нанопорами выявило сложные векторные вставки, опосредованные не только MMEJ, но также негомологичным соединением концов и гомологичной рекомбинацией, по крайней мере, в 17% клонов. Новая полоса появилась после улучшения условий ПЦР, что указывает на наличие непреднамеренно модифицированных аллелей, которые не поддаются стандартному скринингу ПЦР. Это побудило нас охарактеризовать рекомбинацию каждой аллели клонов с отредактированным геномом с использованием гетерозиготных однонуклеотидных полиморфизмов, что привело к подтверждению наличия гомозиготных аллелей. Наше исследование показывает, что необходим тщательный контроль качества клонов с отредактированным геномом, чтобы исключить сложную, непреднамеренную вставку вектора в цель.

В последние годы технология модификации генома значительно продвинулась с появлением системы CRISPR1. Однако при редактировании генома CRISPR всегда возможно возникновение непреднамеренной рекомбинации. Поэтому контроль качества клонов с отредактированным геномом важен для обеспечения того, чтобы предполагаемая рекомбинация в клонах не сопровождалась непреднамеренной рекомбинацией. Непреднамеренная рекомбинация может произойти в целевом сайте рекомбинации или в геномных регионах, удаленных от целевого сайта. Последний тип рекомбинации часто возникает в геномных последовательностях, сходных с целевой последовательностью, вследствие частичного отжига направляющих РНК (гРНК). Такая рекомбинация называется «нецелевым» эффектом, и для ее обнаружения были разработаны различные методы2,3. Что касается предыдущей непреднамеренной рекомбинации «на цели», сообщалось о крупных делециях по всему сайту-мишени4,5,6,7. Обычно представляющие интерес рекомбинанты проверяют с помощью ПЦР. Следовательно, крупные геномные делеции, сопровождающие потерю сайтов связывания праймеров ПЦР, могут остаться незамеченными. Недавно сообщалось о других типах непреднамеренной рекомбинации на мишени, при которых векторы гРНК или митохондриальная ДНК встраиваются в целевой сайт геномного расщепления8. Хотя в этих случаях сайты связывания праймера ПЦР сохранялись, вставка непреднамеренной экзогенной последовательности осталась незамеченной при первоначальном ПЦР-скрининге, поскольку размер ПЦР-ампликона превышал предел обнаружения. Такая непреднамеренная целевая рекомбинация должна быть тщательно изучена, особенно если предполагается редактирование биаллельного генома, поскольку потеря аллеля дикого типа (wt), подтвержденная анализом ПЦР, может быть вызвана не гомозиготным редактированием генома, а комбинацией предполагаемых рекомбинация в одном аллеле и непреднамеренная рекомбинация в другом аллеле.

В настоящем исследовании мы сообщаем о непреднамеренных, сложных паттернах вставки векторов, направленных на цель, которые мы идентифицировали в процессе генерации условных аллелей для системы Cre/loxP в культивируемых клетках. Чтобы создать условный аллель, необходимо вставить две последовательности loxP: одну выше, а другую ниже целевой геномной области. Более того, для проведения фенотипического анализа в культивируемых клетках оба аллеля должны быть модифицированы одинаковым образом. Таким образом, в геном необходимо вставить всего четыре сайта loxP. Для введения чужеродных последовательностей в геном можно использовать различные пути репарации, а именно гомологичную рекомбинацию (HR), негомологическое соединение концов (NHEJ) и микрогомологическое соединение концов (MMEJ). HR является наиболее широко используемым путем и требует гомологического плеча размером 500–1000 п.о. в нацеливающем векторе9. Сообщается, что путь HR активен в основном от поздней фазы S до фазы G2 клеточного цикла10. Напротив, путь NHEJ активен на протяжении всего клеточного цикла10. Таким образом, метод на основе NHEJ позволяет целенаправленно вставлять его в типы клеток, в которых метод HR неэффективен, например, в нейроны, хотя последовательность соединения в сайте рекомбинации трудно контролировать по сравнению с таковой в HR11. Совсем недавно был разработан метод под названием PITCh (точная интеграция в целевую хромосому) с использованием MMEJ12,13. В этом методе для рекомбинации используются микрогомологические плечи длиной всего 10–40 оснований. Сообщается, что путь MMEJ активен в основном от фазы M до ранней фазы S14, что обеспечивает другой режим рекомбинации по сравнению с HR. В настоящем исследовании мы использовали метод PITCh, поскольку вставку последовательности loxP из 34 оснований в геном можно легко обнаружить с помощью ПЦР из-за короткой длины гомологического плеча нацеливающего вектора. Однако ПЦР-скрининг выявил полосы непредвиденных размеров, которые были длиннее, чем ожидалось, при высокой частоте. Анализ этих полос с помощью секвенирования длинного чтения Nanopore выявил сложные векторные вставки, включающие не только MMEJ, но также HR и NHEJ. Размер вставленной векторной последовательности может выходить за пределы обнаружения стандартного метода контроля качества на основе ПЦР для клонов с отредактированным геномом. Мы предлагаем, чтобы непреднамеренная целевая рекомбинация, обнаруженная в этом исследовании, должна быть тщательно исключена на этапе контроля качества редактирования генома.