Моделирование и оптимизация параллельной иммуномагнитной сортировки нанопор для специфической изоляции поверхностных маркеров внеклеточных везикул из сложных сред

Научные отчеты, том 13, Номер статьи: 13292 (2023) Цитировать эту статью

391 Доступов

1 Альтметрика

Подробности о метриках

Выделение специфических субпопуляций внеклеточных везикул (ВВ) на основе экспрессии ими поверхностных маркеров представляет собой серьезную проблему из-за их наноразмера (<800 нм), гетерогенной экспрессии поверхностных маркеров и огромного количества фоновых ВВ, присутствующих в клинических образцах. (1010–1012 ЭВ/мл в крови). Высокопараллельная наномагнитная сортировка с использованием трековых магнитных нанопор (TENPO) позволила достичь точной иммуноспецифической сортировки с высокой пропускной способностью и устойчивостью к засорению. Однако систематического исследования параметров конструкции, которые контролируют компромиссы в пропускной способности, целевом восстановлении электромобилей и способности отбрасывать фоновые электромобили в этом подходе, еще не проводилось. Мы объединяем моделирование методом конечных элементов и экспериментальную характеристику чипов TENPO, чтобы выяснить правила проектирования, позволяющие изолировать субпопуляции ЭВ от крови. Мы демонстрируем полезность этого подхода, уменьшая фон устройства более чем в 10 раз по сравнению с ранее опубликованными конструкциями, не жертвуя при этом восстановлением целевых EV, путем выбора диаметра пор, количества последовательно расположенных мембран и скорости потока. Мы сравниваем ЭВ, выделенные с помощью TENPO, с методами выделения ЭВ, являющимися золотым стандартом, и демонстрируем их полезность для широкого применения и модульность, нацеливаясь на субпопуляции ЭВ из нескольких моделей заболеваний, включая рак легких, рак поджелудочной железы и рак печени.

Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой наноразмерные (< 800 нм) мембранные частицы, содержащие грузы нуклеиновых кислот и экспрессирующие поверхностные белки, которые отражают клетки их происхождения1. Из-за большого количества грузов и способности преодолевать анатомические барьеры, такие как гематоэнцефалический барьер, для циркуляции в периферических жидкостях организма, таких как кровь (1010–1012 ЭВ/мл)2 и моча (1010 ЭВ/мл)3, электромобили стали многообещающий источник биомаркеров для диагностики и характеристики множественных видов рака4,5,6,7,8,9, а также других заболеваний, включая черепно-мозговую травму10 и инфекционные заболевания11. Кроме того, ЭВ играют механистическую роль в биологических процессах, таких как распространение метастазов12 и опухолево-иммунные взаимодействия при раке13, а также в патологиях, включая черепно-мозговую травму14, аутоиммунные заболевания15 и остановку сердца16.

В настоящее время изучение ЭМ и их потенциала для диагностики и терапии сдерживается технологией, которая не была разработана для решения проблемы их уникального сочетания наноразмера, сложности и количества в биологических образцах. Высокая концентрация ЭВ в крови представляет особую проблему для исследователей, стремящихся отличить конкретную субпопуляцию ЭВ от других субпопуляций ЭВ, а также от других частиц, не являющихся ЭВ, таких как клеточный мусор в том же диапазоне размеров (нерелевантный «фон»). . Современные методы выделения ЭВ, такие как ультрацентрифугирование, коммерческие наборы для осаждения (Thermo Fisher, System Biosciences) и эксклюзионная хроматография, не обладают селективностью и производительностью по поверхностным маркерам для точной сортировки субпопуляций ЭВ17.

Аналогичным образом, ранее разработанные методы сортировки клеток по поверхностным маркерам неспособны измерить наноразмерные EV или достичь пропускной способности для обработки большого количества EV, обычно обнаруживаемых в клинических образцах. Например, обработка ~ 1011 ЭВ в 1 мл крови невозможна для высокопроизводительной клеточной проточной цитометрии. Типичные проточные цитометры наночастиц сортируют со скоростью ~ 1000 отсчетов в секунду18, что требует около 3 лет для сортировки 1 мл крови, в то время как даже новейшие системы субклеточной проточной цитометрии, сортирующие со скоростью ~ 60 000 событий в секунду19, потребуют 19 дней для сортировки 1 мл крови. кровь. Эта проблема усугубляется низкой абсолютной экспрессией поверхностных белков на ЭВ по сравнению с клетками из-за резко увеличенной площади поверхности клетки размером ~ 10 мкм по сравнению с ЭВ размером < 800 нм, что приводит к получению флуоресцентных сигналов ниже уровня обнаружения для коммерческие системы проточной цитометрии20. В ответ на эту проблему было разработано несколько микрофлюидных подходов с использованием микро/наномасштабных размеров элементов EV для выполнения точной сортировки EV на основе размера или поверхностных маркеров. Однако такие ограничения, как необходимость сложного нанопроизводства4,21,22, низкие максимальные входные объемы23,24, зависимость от одной мишени молекулярного биомаркера25 или низкая пропускная способность образцов21, препятствовали применимости микрофлюидной сортировки по размеру или сортировке поверхностных маркеров EV.

107 pores/cm2 for d = 600 nm pores5, > 106 for d = 3 µm pores per Cytiva/Whatman). Lastly, track etching combined with vapor deposition of a bilayer, consisting of a soft magnetic layer of NiFe and a passivation layer of Au, offers inexpensive fabrication of large numbers of precisely-defined magnetic nanopores while bypassing expensive and difficult-to-scale lithography5./p> 10% of the magnetic nanopores become occluded. This feature arises because the fluidic resistance of the magnetic nanopores is several orders of magnitude greater than the resistance between pores, and as such when a pore is occluded the flow is distributed not only to its nearest neighbors, but uniformly over the entire 107 pores as if they are in connected in a parallel circuit27. Moreover, in many applications of isolating specific sub-populations of EVs, the subpopulation is sparse (ex. ~ 1900 tumor-derived EVs/mL per mm3 of tumor volume for highly-shedding tumors)28 in comparison to the total number of EVs. Therefore even in a case when TENPO processes 1011 EVs in a mL of human plasma, several orders of magnitude less targeted EVs are captured on the TENPO’s ~ 107 magnetic nanopores. Because our device sorts EVs one at a time, in a device that is matched in scale to that of nanoscale EVs, it can sort EVs based on quantitative expression of surface markers, akin to flow cytometry for cell based sorting. This is in contrast to conventional methods that use micrometer-scale sized beads or devices29, where EV capture is dictated by a single binding event. Moreover, previous immunoaffinity bead isolation methods have been limited by the requirement that a high proportion of EVs express a given target protein30./p>

2.5 mL/h, Rs decreased as a function of flow rate ɸ. At flow rates ɸ < 2.5 mL/h, 1-Rw increased as a function of ɸ, and beyond ɸ > 2.5 mL/h, all weakly targeted EVs were successfully discarded. (Fig. 2C). This model system demonstrates the potential for tuning the tradeoff between Rs and 1-Rw in this model scenario featuring both targeted EVs and off-target EVs with non-specifically bound MNPs./p> 33)./p> 10 mL/h rather than decreasing (Fig. 3C, SI Fig. 11). This difference may be due to differences in magnetic labeling where EVs with greater than 15 MNPs are still captured at high flow rates. We observed no change in isotype-labeled EV RNA at any of the flow rates, in contrast to the predicted decrease in background on simulation. As in the membrane number scan, we hypothesize that the isotype background Cq values are closer to the limit of detection of our PCR assays. We observed the greatest difference between the antibody-labeled versus isotype-labeled EVs at a flow rate of ɸ = 2.5 mL/h (Fig. 3C, SI Fig. 11)./p> .05), while for GAPDH there was a significant difference between the antibody replicates (p = .014) but not the isotype replicates (p > .05)./p> 1000) of clinical samples are required. By virtue of its low construction/operation cost (cost for one pan-EV prototype TENPO assay = ~ $35; $12 material/fabrication5, $5 antibody, $18 beads) and compatibility with roll-to-roll manufacturing, TENPO could be scaled up to fast chip manufacturing while also having the throughput for large clinical cohorts. The fabrication cost of TENPO is invariant to pore diameter, unlike most microfluidic approaches which rely on lithographic fabrication. Previous work in our group with TENPO using 600 nm pores to isolate EV subpopulations was able to yield clinically-relevant diagnostic information in n = 204 pancreatic cancer samples6 as well as in n = 96 traumatic brain injury samples10. In these cases, TENPO using 600 nm pores was able to distinguish biological nucleic acid signals from background, which can be improved even further with the 10× improvement in specificity versus isotype background suggested in this manuscript./p>

~ 3 × 109 EVs for pancreatic cancer, 1 mL—> ~ 9 × 1010 for lung cancer, 1 mL—> ~ 9 × 108 for liver cancer) into healthy human plasma (0.75 mL healthy human plasma for pancreatic cancer, 0.25 mL healthy human plasma for lung and liver cancer; plasma has an EV concentration of 2 × 1012 EVs/mL as measured via NTA). Equivalent volumes of non-conditioned clean culture media (media not exposed to cancer cells) were added to the volumes of healthy human plasma stated for each cancer media type to make the “healthy” samples./p>

Блог