Создание биобанка Plasmodium vivax для функциональных анализов ex vivo.
Журнал «Малярия», том 22, номер статьи: 250 (2023 г.) Цитировать эту статью
Подробности о метриках
Plasmodium vivax является второй по распространенности причиной малярии, однако ее изучение остается сложным из-за отсутствия системы непрерывного культивирования in vitro, что подчеркивает необходимость создания биобанка клинических изолятов с несколькими замораживаниями каждого образца для использования в функциональных анализах. Были сравнены различные методы криоконсервирования изолятов паразитов и впоследствии валидирован наиболее перспективный из них. Обогащение паразитов на ранних и поздних стадиях, а также созревание паразитов были количественно оценены для облегчения планирования анализа.
Для сравнения протоколов криоконсервации девять клинических изолятов P. vivax были заморожены с четырьмя смесями на основе глицеролита. Восстановление паразитов после оттаивания, после обогащения KCl-Percoll и в краткосрочной культуре in vitro измеряли с помощью предметной микроскопии. Было измерено обогащение паразитов на поздних стадиях с помощью магнитно-активированной сортировки клеток (MACS). Также сравнивали краткосрочное и долгосрочное хранение паразитов при температуре – 80 °C или жидком азоте.
Из четырех смесей криоконсервации одна смесь (глицеролит:сыворотка:эритроциты в соотношении 2,5:1,5:1) приводила к улучшению восстановления паразитов и статистически значимому (P <0,05) увеличению выживаемости паразитов в краткосрочной культуре in vitro. Впоследствии с использованием этого протокола был создан биобанк паразитов, в результате чего была собрана коллекция из 106 клинических изолятов, каждый из которых содержал 8 флаконов. Качество биобанка было подтверждено путем измерения нескольких факторов из 47 оттепелей: среднего снижения паразитемии после оттаивания (25,3%); среднее кратное обогащение после KCl-Percoll (6,65-кратное); и средний процент выздоровления паразитов (22,0%, измеренный по 30 изолятам). При кратковременном культивировании in vitro у 60,0% изолятов к 48 ч наблюдалось устойчивое созревание паразитов кольцевой стадии до более поздних стадий (>20% трофозоитов, шизонтов и гаметоцитов). Обогащение зрелых стадий паразита с помощью MACS показало хорошую воспроизводимость: в среднем 30,0% паразитемии после MACS и в среднем 5,30 × 105 паразитов/флакон. Наконец, было проверено влияние температуры хранения, и не наблюдалось значительного влияния краткосрочного (7 дней) или длительного (7–10 лет) хранения при -80 °C на восстановление, обогащение или жизнеспособность паразитов.
Здесь оптимизированный метод замораживания клинических изолятов P. vivax демонстрируется как шаблон для создания и проверки биобанка паразитов для использования в функциональных анализах.
Plasmodium vivax является наиболее географически распространенным видом малярийных паразитов и является вторым по величине бременем малярии в мире. Хотя общая заболеваемость P. vivax во всем мире снизилась с 20,5 миллионов случаев в 2000 г. противомалярийные препараты.
Исследования фундаментальной биологии P. vivax были сильно ограничены из-за отсутствия системы непрерывного культивирования in vitro [2,3,4]. Отсутствие непрерывного культивирования приводит к необходимости использования клинических изолятов P. vivax для экспериментальных исследований, а ограниченный доступ к этим изолятам препятствует прогрессу в расширении знаний об этом паразите. Недавно были разработаны краткосрочные подходы к культивированию P. vivax in vitro (включая в некоторых случаях использование криоконсервированных изолятов) [3, 5, 6], что позволяет проводить одноцикловые исследования лекарственной устойчивости [3, 7]. а также анализы инвазии для оценки тропизма ретикулоцитов хозяина [8], эффектов ингибирующих инвазию антител [9,10,11,12,13,14,15,16] и мутантов рецепторов хозяина [17, 18]. Растет признание важности биобанков образцов инфекционных заболеваний [19,20,21], включая Plasmodium falciparum [22,23,24]. Создание биобанка криоконсервированных изолятов P. vivax, которые можно будет надежно разморозить для дальнейших экспериментов (функциональные анализы, анализы экспрессии генов, геномика), станет критически важным ресурсом для дальнейшего развития в этой области [4].